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大鼠坐骨神经内注射一氧化氮供体致轴突组织学改变的观察……刘秀芬 杨拔贤 (177)

(这条文章已经被阅读了 1792 次) 时间:2004/02/04 07:54am 来源:山东麻醉论坛


《中国麻醉与镇痛》杂志  2003-03-177

【摘要】  目的:观察一氧化氮(NO)供体对大鼠外周神经轴突的作用,探讨其是否能够在神经溶解术中发挥作用。方法:选择78只雌性PVG大鼠,分为实验组和对照组,以在体神经内微注射实验方法,将三种半衰期不同的NO供体(DETA NONOate,DPTA NONOate和Spermine NONOate)及生理盐水分别注入大鼠左侧坐骨神经的神经束膜下,于注射后的不同时间(1天、2天、3天、7天和14天)取出注射部位的坐骨神经,经组织学处理后做成树脂包埋块,以超薄切片机切片,然后在高倍显微镜下观察并计数神经横断面的变性轴突数目。结果:在本实验条件下,应用三种NO供体的低浓度,都不能引起大鼠坐骨神经轴突的改变;将DETA NONOate浓度加倍则可导致轴突脱髓鞘和沃勒变性,但对有髓鞘纤维和无髓鞘纤维并无选择性作用。结论:在本实验条件下,NO供体导致外周神经轴突脱髓鞘和变性的作用与其浓度呈正相关,但对感觉神经纤维并无选择性溶解的作用。

【关键词】  一氧化氮;轴突变性;慢性疼痛;神经内注射

Histological Observation on Axons Sciatic Nerve Using the Intraneural Injection Technique with Nitric Oxide Donors in Rats. Liu Xiufen, Yang Baxian. Department of Anesthesiology, the First Hospital of Beijing University, Beijing 100034, China.

【Abstract】  Objective  To observe the effect of nitric oxide(NO) donors on rat sciatic nerve, to discuss whether or not the NO could play a role in neurolysis. Methods  Seventy-eight adult female PVGrats were divided into experimental group (n=60) and control group (n=18), intraneural injection technique was used to supply three kinds of NO donors with different half-life(DETA NONOate, DPTANONOate and Spermine NONOate) or saline into the rat sciatic nerve subperineurally under light microscope. At the 1th,2th,3th,7th,and 14th day of duration  after sciatic nerve injection, a segment of injected sciatic nerve was taken out and embedded it in TAAB resin after tissue processing. Then it was cut into thin layers (1μm) and the histological changes were observed under high power microscope, meantime the number of degenerated axons were counted. Results  Under our experimental conditions, three kinds of NO donors when in lower concentrations could not cause obvious changes of axons while when the concentration of DETA NONOate was doubled, it could induce the non-selective demyelination and Wallerian degeneration of both sensory and motor nerve fibers. Conclusion  The NO affects on peripheral nerve fibers with concentration dependence and non-selection on sensory and motor fibers.

【Key words】  Nitric oxide; Axonal degeneration; Chronic pain; Intraneural injection    

  神经阻滞术是治疗疼痛症的有效方法之一,其中利用物理或化学手段破坏神经纤维以达到治疗慢性疼痛的方法,称之为“神经溶解(破坏)术”。常用的神经溶解剂为酒精和石碳酸,但都存在某些副作用,且对感觉神经纤维和运动神经纤维的破坏无任何选择性。因此,找出一种具有选择性破坏感觉神经纤维的神经溶解剂,对慢性疼痛的治疗将会带来曙光。大剂量、高浓度NO对神经系统具有神经毒[1~3]。但这种影响的组织学病理基础尚未见澄清。本实验的目的在于对同种大鼠在不同NO供体,及同一NO供体不同时间和不同浓度的神经内注射后,观察其轴突的变化。如果NO能引起神经轴突变性,尤其是选择性无髓鞘纤维变性,则将有希望取代传统的酒精和石碳酸,作为一种新型的神经溶解剂来治疗慢性疼痛。

1  材料与方法

1.1  动物分组和试剂

选用78只雌性PVG大鼠,体重154~213g(中位体重183.6g),随机分为实验组和对照组:①对照组共18只,神经内注射生理盐水6只,DETA 6只,DPTA 6只,饲养7天。DETA和DPTA由DETA NONOate和DPTA NONOate酸化(配制至pH<5)后释放出NO而制成;②实验组共60只。其中低浓度NO供体组36只,分别用三种供体:DETA NONOate(38.3mM)组(半衰期1200min),注射后饲养1天、2天、3天和14天各6只,饲养7天12只。DPTA NONOate(26.0mM)组(半衰期180min)6只,饲养7天。Spermine NONOate(19mM)组(半衰期39min)6只,饲养7天。高浓度NO供体组用DETA NONOate(76.5mM)组12只,饲养7天。

1.2  实验方法

①大鼠到达动物房一周后开始实验。以2%~3%氟烷吸入诱导麻醉,用1.5%~2%氟烷吸入维持麻醉。根据呼吸深浅调整麻醉深度。
②实验在室温、无菌条件、解剖显微镜(瑞典Wild M650)下进行。经肛门监测体温(美国FHC Brunswick体温监测仪)。
③大鼠于实验台上置于右侧卧位,沿左腿股骨切皮,分离肌肉,在股骨中部暴露坐骨神经。
④在显微镜观察下,将玻璃微注射器(用P-80/PC微注射器制作仪自制,直径1.0mm,最大容积10μL),针的尖端轻轻插入坐骨神经的束膜下,分别在坐骨神经胫支和腓总支各注入2μL试剂(见分组),注射部位以黑炭作标记。
⑤逐层缝合伤口,停止吸入麻醉。待大鼠苏醒,每天定时观察左腿,有无肌力弱减(与右腿对比),破足及行走困难,直至预定的天数。
⑥测定NO供体释放的NO浓度。使用每次神经内注射后所余的NO供体,用Digltal Model10电极(Rank Brothers Ltd,England)及NO测定仪,测定不同时间每种供体释放的NO浓度。
⑦在低浓度DETA NONOate组,于神经内注射后第1、2、3、7、14天,其他组均于第7天,在深麻醉(5%氟烷)下,用3%戊二醛行心内灌注固定。在显微镜下将标记处的坐骨神经取出长2cm的一段,再用3%戊二醛行外固定24h。
⑧将每段神经标本以标记处为界,头侧横切两小段(每小段2mm),尾侧横切四小段,进行组织学处理:用1.5%四氧化饿酸行后固定,用递增浓度的酒精(30%、50%、70%、90%和100%)分次脱水,经过氧化丙烯包埋于TAAB树脂中。
⑨用超薄切片机对坐骨神经组织块施行横断面切片,厚度为1μm。用甲苯铵蓝0染色。在显微镜下观察并拍照。在高浓度NO组用Sigmascan Pro5程序,计数变性轴突。

2  结果

2.1  大体观察  全部大鼠无左腿肌力减弱、破足、行走困难等神经损伤表现。神经内注射后一天打开伤口,在光镜下见神经略有水肿;神经内注射后三天以上可见坐骨神经与周围肌肉组织出现粘连。

2.2  NO浓度  鉴于本实验所用的电极性能不足,未能测出我们所配制浓度的NO供体所释放的NO浓度。因此,我们将每种供体稀释1000倍再进行测量,根据所得出的曲线图推算我们所用浓度的NO供体释放的NO浓度。在37℃,pH7.4的条件下,推算的结果见附表。

2.3  光镜观察  

2.3.1  采用10倍、20倍、40倍光镜和100倍油镜观察所有的切片,均可明显看到散在于神经轴突之间鼓涨的毛细血管及其内皮细胞,血管的形状提示戊二醛心内灌注固定的效果较好。在PVG大鼠对照组(生理盐水)和DETA组及DPTA组,均未见神经脱髓鞘和轴突变性(如髓鞘消失,轴突溶解,或轴突被巨噬细胞吞噬)的表现(图1)。

2.3.2  在PVG大鼠低浓度DETA NONOate组,神经内注射2μL后存活1天、2天、3天和14天的大鼠,坐骨神经切片均未见明显的异常改变(图2)。20倍光镜下观察存活1天的大鼠坐骨神经切片,可见神经束膜下水肿。为验证不同的NO供体的效果,我们还用了另两种半衰期较短的供体,DPTA NONOate和Spermine NONOate,观察神经内注射7天后轴突的变化。但它们和DETA NONOate一样,均未能引起轴突的脱髓鞘和变性(图3)。2.3.3  为比较不同浓度NO对轴突的影响,我们将DETA NONOate浓度加倍,使之释放出76μMNO,结果发现高浓度NO可致轴突脱髓鞘和沃勒变性。图4上图,可见完整的坐骨神经横断面图像。图4的下图,可见原来有髓鞘的轴突失去髓鞘,仅被雪旺细胞包围;巨噬细胞吞噬有髓鞘和无髓鞘的轴突以及髓鞘碎片;另外本图的左上方可见如小米粒样成簇的无髓鞘C纤维。未被破坏的有髓鞘轴突之间的间距加大,可能是分散其间的C纤维被破坏的结果。

3  讨论

  急性疾病痊愈后疼痛持续存在,且超过6个月者,称之为“慢性疼痛”[4],由于疼痛持续,又难以治愈,病人躯体和精神痛苦甚大,经济负担也沉重。为提高慢性疼痛病人的生活质量,探索有效治疗慢性疼痛的方法和药物是疼痛治疗学研究的一项艰巨任务。

3.1  C纤维是主导慢性疼痛传导的无髓鞘纤维,直径小(0.2~1.5μm),传导速度慢(<2m/s),可耐受高阈值化学、机械和热的刺激[4,5]。在高倍光镜和电镜下可清楚看到C纤维的形态和数量。传统的酒精和石碳酸通过其凝固蛋白质可致神经轴突沃勒变性,从而破坏神经[6],但这种破坏对神经纤维大小、类型、感觉神经和运动神经毫无选择性,因此可在治疗疼痛的同时带来一些副作用,如神经毒和血压降低等。因此,这类方法只适用于生存时间有限的病人,例如顽固性癌痛[6,7],非癌性的顽固性疼痛,如带状疱疹疤疹后顽固性神经痛、慢性胰腺炎疼痛[5]

3.2  为治疗慢性疼痛,我们根据NO具有神经毒的特性,以及神经内注射NO可能引起轴突变性,且可能具有选择性引起无髓鞘C纤维的轴突变性的特性,选用了NO神经内注射技术。神经内注射技术较常用于神经病理学研究,用微注射器将药物注射在神经束膜下,以观察药物对神经的病理作用。此技术本身对神经的直接影响很小,但针尖粗细、注射速度、注射液容积及动物的活动等因素都可影响神经的病理变性[8]。本实验的生理盐水对照组结果显示,未出现轴突变性及脱髓鞘等病理表现,说明本实验所采用的神经内注射技术本身,不致引起神经变性,技术可靠和实验有效。

3.3  在本实验条件下,注射低浓度NO供体并没有验证我们的假设,使用不同的低浓度NO供体,以及同一种供体在同样浓度下的作用时间内均呈阴性结果。但是提高NO供体浓度,则能使大鼠外周神经的有髓鞘纤维和无髓鞘纤维出现脱髓鞘和轴突变性。此项结果初步表明NO致轴突变性作用具有浓度相关性,这与Garthwaite等的实验结果相符。他们的实验结果还表明在NO供体作用下,轴突和大神经胶质细胞变性与时间及浓度相关[9]。但他们的实验对象是大鼠视神经,研究中枢神经系统白质的离体实验,所用的NO供体产生1~25μM。而本实验对象是大鼠坐骨神经,研究外周神经的在体实验,体外测定NO供体所释放的NO浓度较高(30μM~76μM)。

3.4  在体实验的影响因素多于离体实验,除全身影响外,还有局部血流和血液成份与NO的相互作用等,都可通过影响NO的代谢而影响其在体内的作用。我们在组织学切片看到坐骨神经内有许多毛细血管,因此不能排除NO供体被直接注入毛细血管内,从而可能不在神经内产生作用。另外,NO供体注入神经内后,在其半衰期内所能释出的NO浓度,是否与体外释放的浓度相等,也是目前尚未解决的问题。一些研究认为NO浓度达到纳摩尔(nM),即具有细胞毒作用[1]。本实验的低浓度NO供体组所释放的NO浓度已达微摩尔(μM),理论上已经能够引起髓鞘或轴突的变化,但我们却没有收到预期的结果,其中的一个可能原因是NO发挥作用之前,就已经在注射和释放部位被清除掉了。NO的分子结构决定了它的特点,在生物机体内的半衰期仅30秒,且分子小容易弥散,可很快从注射部位弥散,并通过毛细血管内皮细胞,与红细胞中的血红蛋白起反应。血红蛋白是NO在体内的一个主要清除剂[10]。氧合血红蛋白和氧合肌红蛋白都能与NO起快速反应,生成亚硝酸盐和正铁血红蛋白:Fe(II)02+NO→Fe(III)+NO3-,反应速度常数k为3.7×107/M·S[11],比02与血红蛋白的反应速度还快(k=7.14×104/M·S)。02能以很快的速度从红细胞弥散到离血管100μm以远的细胞,以供应这些细胞的需要。NO比02弥散得快,且具有疏水性,易通过细胞膜,有关的计算表明在1秒内它能弥散到超过100μm以远的血管里。在血管里NO被血红蛋白灭活,生成代谢产物亚硝酸盐[10,11]。这可能是本实验采用低浓度NO的条件下,不能引起神经轴突变性的原因之一。


3.5  NO与血红蛋白的反应也存在一定的“饱和度”。如果将NO浓度提高,使氧合血红蛋白不能清除NO供体所释放的全部NO,此时NO就会发挥它的神经毒副作用,即影响线粒体功能、减少能量产生等而引起轴突变性。这可能是本文在体实验采用高浓度NO导致神经轴突变性的原因之一。在本实验条件下,高浓度NO引起的轴突变性对有髓鞘纤维和无髓鞘纤维并无选择性,即不能选择性破坏C纤维。而神经受损伤时,由于C纤维无髓鞘保护,因此比有髓鞘纤维更容易被破坏[4]

  在实验中如果能做到逐步递增NO浓度,也许能够找到只破坏C纤维而不影响有髓鞘纤维的“临界”浓度。我们期望本实验在今后能够进一步发现体内引起轴突变性的NO浓度“阈值”(即超过此浓度就能够引起轴突变性,低于此浓度则不引起轴突变性),以及能够选择性引起有髓鞘纤维和无髓鞘纤维变性的NO临界浓度;并探索高浓度NO神经内注射对全身的影响。如果能够发现选择性破坏C纤维而对全身副作用影响小的NO浓度,则将为NO在慢性疼痛治疗中的可行性提供一定的实验基础。

参考文献

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2.Dawson VL, Dawson TM. Physiological and toxicological actions of nitric oxide in the central nervous system. Advances in Pharmacology 1995,34:323~342.
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4.Wall PD, Melzack R. Textbook of pain (4th edition). Churchill Livingstone, New York 1999.
5.Kanner R. Pain management secrets. Hanley [sup][ Belfus Inc, Philadelphia 1997.
6.McGarvey ML, Ferrante FM, Patel RS, et al. Irreversible spinal cord injury as a complication of subarachnoid ethanol neurolysis. Neurology 2000,54:1522~1524.
7.Leon-Casasola CA. Critical evaluation of chemical neurolysis of the sympathetic axis for cancer pain. Cancer Control 2000,7:142~148.
8.Dyck PJ, Lais AC, Hansen SM, et al. Technique assessment of demyelination from endoneurial injection. Experimental Neurology 1982,77:359~377.
9.Garthwaite G, Goodwin DA, Batchelor AM, et al. Nitric oxide toxicity in CNS white matter: an in vitro study using rat optic nerve. Neuroscience 2002,109:145~155.
10.Vincent SR. Nitric oxide in the nervous system. Academic Press, London 1995.
11.Huang Z, Louderback JG, Goyal M, et al. Nitric oxide binding to oxygenated hemoglobin under physiological conditions. Biochimica et Biophysica Acta 2001,1568:252~260.


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